扩增子测序常见问题
1、什么是扩增子测序？
扩增子测序主要通过对特定长度基因的 PCR 产物进行测序分析，针对环境样本，16S/18S/ITS 等基因扩增子测序是研究环境微生物多样性及群落组成差异的重要技术手段之一。更多详细内容参见产品资料-2.扩增子测序研究方法
2、常见的扩增子测序有哪些？
根据不同的研究目的和需求，罗宁生物提供5种扩增子产品：16S rDNA 测序、18S rDNA/ITS 测序、功能基因区域测序、GS-Sequencing植物内生菌测序和InDel区域测序。
3、扩增子测序能应用到哪些领域？
按应用领域，罗宁生物环境微生物可向以下领域提供测序分析服务：
1>工业微生物
酿酒、乳制品微生物，油气微生物等
2>农业微生物
动植物病原菌、食用菌、生物固氮菌等
3>医学微生物
病原微生物、肠道微生物、泌尿道微生物、消化道微生物、呼吸道微生物等
4>环境微生物
土壤、空气、水体微生物
4、16S/18S/ITS测序目前能提供哪些分析服务？
罗宁生物16S/18S/ITS测序目前针对客户样本可提供基础分析、标准分析及高级分析，具体分析内容参见产品资料-附件一分析报告模板第4页所列内容，该页未列出内容为定制分析，需按具体项目而定。环境微生物多样性分析内容总体上可分为alpha多样性分析、beta多样性分析和物种差异分析等内容。根据客户样本量，当客户样本量低于3个，仅提供alpha多样性分析。
5、植物内生菌（细菌/真菌）扩增子测序和其他公司提供的扩增子测序服务有什么差别？
罗宁生物多年致力于环境微生物样本多样性测序分析，现在我们更推出针对植物来源复杂样本的Green Shield Sequencing技术，从源头上消除样本中叶绿体和线粒体以及宿主基因组等序列带来的干扰，还原样本微生物的真实比例。Green Shield Sequencing技术是罗宁生物最新研发的针对植物内生菌测序的优质测序服务，测序流程与普通高通量测序无异，但重要的是可在较小的测序数据量中获得更真实的内生菌信息。根据目前测序数据，采用Green Shield Sequencing技术最多可将宿主污染降低至5%/0.03%（16S/ITS）。
6、植物内生菌测序只能用于植物研究吗？
罗宁生物植物内生菌测序不仅可用于植物研究，对于植食性动物肠道微生物研究具有极大的优势。Green Shield Sequencing真菌测序技术对于目前研究较多的植物菌根研究具有极大的优势。
7、罗宁生物16S扩增子测序目前研究的是哪一个片段？
罗宁生物16S扩增子测序目前研究的是V4高变区的515bp-806bp的片段。如果客户有其他研究需求，可定制分析方案。
8、罗宁生物16S扩增子测序为何选取515-806区域进行测序？
在细菌物种鉴定方面，使用位于V4区的U/E515F引物的覆盖度达到99%-99.1%，与此同时下游引物E806R的覆盖度也达到了95.10%；根据试验目的的不同，如下游引物使用U909R则会检出更大比例古菌。因此，选择U515F/U806R引物对在细菌检出率上具有绝对的优势。同时，515F/806R对扩增子平均长度为291bp，相较于使用V3-V5区引物E341F/U909R或U341F/E785R扩增子566bp和444bp来说长度更短，在短片段测序具有更大优势的Illumina测序平台来说，更小的扩增子测序引入的测序误差更低，Q值更高，测序结果更加真实可靠。因此，U515F/U806R引物对的使用更能真实反映细菌群落结构的信息。
9、罗宁生物扩增子测序平台是什么？为什么不用454测序平台？
罗宁生物扩增子测序采用Illumina平台。罗氏454平台目前试剂已停产且通量较低，所以目前均采用Illumina平台测序。
10、罗宁生物扩增子测序使用的是Illumina原装试剂吗？
罗宁生物扩增子建库测序均采用原装Illumina试剂，建库更采用Illumina TruSeq DNA PCR-Free LT Library Prep Kit建库试剂盒降低批次间误差。
11、罗宁生物扩增子测序能提供多少测序量？
根据客户的要求及样本不同，罗宁生物提供5000-200000Tags的测序量。默认情况下，我们提供不低于10000Tags，平均30000Tags的测序量。
12、扩增子测序测序量是越大越好吗？
罗宁生物始终坚持够用就好的原则，并非更大的测序量会带来更好的结果。通常情况下，加大测序量是为了进行低丰度研究。
通常情况下，细菌及古菌建议测序量是10000Tags-20000Tags，真菌建议测序量在5000Tags左右。
13、从提供样本到获得分析数据的时间是多久？
通常在样品检测合格后30-40天内完成测序分析。
14、样本该如何寄送？
A. 当您的样本属于温度敏感型样本，请使用低温介质（冰袋/干冰）辅助运送，包装要求如下：
1>将样本放入合适大小的螺口离心管中，样本量不要超过离心管的四分之三，管上注明样品名称及制备时间，管口用Parafilm封口。建议在运输前将离心管置于离心管架/盒上，再用自封袋密实；
2>将样本置于泡沫保温盒中，加入足量干冰或低温冰袋，此时您可联系物流公司封存样本后邮寄，为加固泡沫盒，您可在最外层套上一层瓦楞纸盒；
3>确定样品不会松动摇晃之后可邮寄。
B. 当您的样品对环境温度不敏感，包装要求如下：
1>将样本放入合适大小的螺口离心管中，样本量不要超过离心管的四分之三，管上注明样品名称及制备时间，管口用Parafilm封口。建议在运输前将离心管置于离心管架/盒上，再用自封袋密实；
2>将装有样本的离心管架/盒放入瓦楞纸盒，随后使用气泡膜固定后邮寄。
15、样本是否要设置重复？
罗宁生物提供的高级分析均需要客户提供至少三个生物学重复。为了获得更好的试验结果，建议设置6-20个重复。
16、客户需要提供什么样品？
客户可提供原始样本或纯化核酸样本。
17、样品上样量不同及其clean data不同，会不会对多样性分析和差异比较分析有影响？
首先，上机时都会对样品进行定量检测，使用Qubit荧光定量，在某一合适浓度范围内才会上机测序，两个样品间不会有很大的浓度差。
其次，在做多样性分析的时候或在统计分析之前会对数据进行重抽样使样品具有相同的序列数以避免测序深度对结果的影响。所以差异表达分析和多样性分析中不用担心上样量或数据量不同对结果的影响。
18、DGGE技术与Illumina平台高通量测序技术在环境微生物群落多样性研究中有什么区别？
DGGE等分子指纹技术，在其实验结果中往往只含有数十条条带，只能反映出样品中的优势种群，无法得到细菌种类的全面信息。而基于Illumina平台的高通量测序技术能同时对样品中的优势种群及微量的劣势种群进行检测，获得样品中的微生物群落组成，并将其含量进行数字化。
19、罗宁生物双Barcode技术优势
双Barcode技术通过在扩增子两端加入不同的Barcode从而排出了样品间的序列拼接产生嵌合体的可能。
20、在菌根研究中使用什么引物？
在菌根的研究中我们推荐使用GS-Sequencing针对菌根的特异性引物。当然，如选择普通引物，建议使用AMV4.5NF和AMDGR引物对，如没有特殊需求，请不选择NS31引物与AM1/AM2引物的混用。
21、近期有发表文章表明使用16S rRNA基因的799F-1391R和799F-1193R对植物来源线粒体和叶绿体同源基因进行了抑制，该方法是否可以替代GS-Sequencing植物内生菌高通量测序？
罗宁生物GS-Sequencing植物内生菌高通量测序采用经修饰的抑制植物来源同源基因的引物混合物是目前无偏差测序的最佳选择，GS-Sequencing最终使用16S V4区（515-806bp）及ITS1/2区域（菌根采用AMVD引物）,保证最佳数据质量及可靠性。近期有发表文章表明使用16S rRNA基因的799F-1391R和799F-1193R引物对在杨树材料中进行了研究，结果显示799F-1391R扩增片段接近600bp，不能在当前主流illumina平台完成测序，另一引物799F-1193R扩增结果alpha多样性低，并不能真实反应样本真实情况。与此同时，这两对引物使用覆盖度较低的V5-V6-V7高变区，总体上看，该文章中筛选出的引物还需更进一步优化。
GS-Sequencing植物内生菌测序常见问题
1、预约GS-Sequencing测序对样品有哪些要求？
罗宁生物GS-Sequencing测序收取的样本仅限总DNA样本及干冰储运的样品鲜样，与环境微生物测序样品一致。我们也接受DNA冻干样本，但最好将样本溶于Elution Bffer（10mM Tris-HCl, pH8.0)缓冲液寄送，具体要求如下：
1>总DNA样本（GenomicDNAsample）：为获得良好数据，请确保送样体积大于30µl ，浓度介于50-100ng/µl为宜，送样前请使用nano drop、PicoGreen等测量各样本浓度，并将A260/A280、A260/A230值填写于《样品信息表》。我们不建议使用浓度低于10ng/µl的样本。
2>如提供干冰保藏的鲜样，请提前7个工作日与我们联系获取物流建议（因季节不同可能有差异）。
3>您的样本在获得测序数据以后我们将免费为您保存原始样本90天，您可在此期限内申请取回样本，具体信息请联系tech@rhonin-bio.com获取相应支持。
*样本总DNA建议您采用CTAB法纯化，
2、目前已有哪些样本使用过GS-Sequencing测序？
罗宁生物在环境微生物样本多样性分析中积累多年经验，目前针对植物内生菌的 GS-Sequencing测序服务对以下植物样本进行了测序：
拟南芥、紫花苜蓿、苹果（叶）、杏（叶）、芥菜、芦笋、燕麦、香蕉、大麦、葫芦、仙人掌、山茶、油菜、洋甘菊、樱桃、柑橘、三叶草、菜豆、玉米、豇豆、黄瓜、蒲公英、茄子、高羊茅、亚麻、葡萄辣根、独活、麻、浮萍、扁豆、莴苣、枸杞、洋葱、兔（肠道）、矮牵牛、牛（肠道）、蜗牛（肠道）、蚱蜢（肠道）、羊（肠道）、绿豆、烟草、桃、车前草、马铃薯、萝卜、玫瑰、高粱、大豆、草莓、向日葵、柳枝稷、番茄、树番茄、柳、大叶草、牡丹、水稻。
如您正在准备进行植物内生菌测序实验或环境微生物样品多样性实验，我们可提供尽可能多的试验优化方案供您选择，更多信息请联系tech@rhonin-bio.com获取相应支持。
3、GS-Sequencing测序服务的试验周期多长？
试验周期与普通环境微生物多样性测序服务一样，为45-60天。
4、GS-Sequencing内生菌测序技术与其他Meta16S测序有何差异？
罗宁生物在环境微生物样本多样性测序分析领域具有多年经验，独创的GS-Sequencing内生菌测序技术从源头控制质体和线粒体的污染，还原样本微生物真实比例。在与以往Meta 16S测序的流程上没有差别，均为16S rDNA目的片段扩增-建库-测序-分析四个步骤，而对质体线粒体序列的去除过程对样品微生物信息无影响。
动植物基因组重测序常见问题
1、重测序需要多少覆盖度？
重测序的覆盖度是由所测样品的物种及合作伙伴的具体需求决定的。例如，Illumina测序平台进行人类基因组重测序，如要获得绝大多数的变异信息，覆盖度需达30×以上。
2、如何验证重测序的结果？
通过全基因组重测序一般能够发现SNP、SV、CNV、InDel等多种遗传变异，不同的变异类型，其验证方法也各不相同。 1> SNPs可以通过PCR扩增包含该SNP位点的区段，并进行测序；或采用SNP分型检测的方法验证。 2> CNVs可通过Real-time PCR对存在拷贝数变异的片段进行扩增，并根据CT值估算不同个体的拷贝数变化倍数。 3> 小的SVs可通过PCR扩增和测序辨别，而大的SVs则需要通过亚显微方法发现，如FISH等。 4> 小片段的InDel，可通过PCR扩增，利用Sanger法测序进行验证。
转录组测序常见问题
1、研究基因差异表达分析的常用软件？
对于没有生物学重复的转录组数据进行差异表达分析时常用的软件有DEGseq、Useq、Cufflinks中的Cuffdiff模块等。
2、核酸平台是否会对客户样品进行 DNase处理？
建议客户送样前自行对样品进行 DNase 处理，建库前的 DNase 处理只能处理痕量DNA 模板残留。
3、转录组建库过程中是用随机引物进行反转录，还是用 oligo(dT)做反转录？
常规建库采用随机引物进行反转录，如有特殊要求可采用 oligo(dT)或者两种都采用。
4、与基因芯片相比，转录组高通量测序有什么优势？
基因芯片是用已知序列的探针和样本mRNA进行杂交来获得mRNA的序列信息的，如果样本mRNA以前从来没有报道过，那么基因芯片上面就不会有相应的探针序列，也就检测不到新的mRNA；另外，核酸杂交的背景噪音很高，存在交叉杂交现象。转录组是直接对样本mRNA进行测序，能够发现很多新的mRNA；转录组测序对基因表达上调或下降的检测范围能够达到上万倍，远比基因芯片的百倍左右要灵敏,而且在有参考基因组的情况下，通过转录组测序还可以分析可变剪切、基因结构变异、全基因组水平基因表达丰度等情况。
5、转录组测序后有何验证方法？
转录组测序后可通过实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）技术来验证测序结果。
基因组测序常见问题
1、重复序列是否影响数据拼接？
重复序列会对数据拼接造成一定影响。通过构建不同梯度的Paired-End文库并采用Miseq平台进行测序，可以对重复序列引起的错拼进行校正。当前的拼接软件所采用的算法在一定程度上也会减少重复序列造成的错拼。
2、对于GC含量过高或过低的基因组，能否通过测序达到相应组装标准？
GC含量大于65%或者小于35%时，测序和组装难度均增加，通过使用三代和二代测序相结合的方式进行测序，并根据基因序列特性选取合适组装方式对基因组序列进行拼接。以最大程度的获得序列信息。
3、如何制定de novo真菌基因组测序的策略？
真菌基因组的重复序列、GC含量、染色体数目等是影响基因组de novo拼装效果的关键因素，其中重复序列常常会导致基因组的错误组装。为了尽量避免重复序列的影响，在进行de novo真菌基因组测序时，可构建多种不同长度插入片段的文库，进行测序和拼接，以跨越不同长度的重复序列，在基因组拼接时，由于不同物种基因组的重复序列结构分布不同，采取的拼接策略也会略有不同。
4、如何对真菌基因组重复序列结构进行估算？
一般系统发育相近的物种，它们的重复序列结构也比较相近，所以可参照近缘物种基因中的重复序列结构情况对待测真菌基因组重复序列结构进行估算。